茶黄素是红茶的主要成分之一，是多酚类物质氧化聚合形成的一类具有苯并卓酚酮结构的植物酚性色素的总称。迄今为止，已从红茶或多酚类物质氧化聚合物中分离鉴定出25种茶黄素类物质 ，其中4种含量最高，分别是茶黄素、茶黄素-3-单没食子酸酯、茶黄素-3’-单没食子酸酯和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯。茶黄素类物质呈橙黄色，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇和乙酸乙酯等溶剂，具有强烈的收敛性，其含量仅占红茶干物质的0.3%~2.0% ，但它不仅是红茶品质的重要影响因子，对红茶的汤色、滋味和叶底都起着举足轻重的作用，而且还具有降血脂、抗氧化、抗病毒、抗癌及预防心脑血管疾病等^[3-6]多种药理功效，在食品、医药和日用化工等方面具有广阔的应用前景，是一类极具开发潜力的茶叶天然产物。因此，研究开发茶黄素的提取制备技术意义重大。

一、茶黄素的提取制备技术

根据茶黄素的理化性质和组成，茶黄素提取制备技术主要包括溶剂浸提法、体外氧化制备法，以及工艺上比较成熟的柱层析法。

1．溶剂浸提法

溶剂浸提法主要是根据儿茶素易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇和乙酸乙酯等溶剂，难溶于乙醚，不溶于三氯甲烷和苯的化学特性，利用茶黄素和红茶中其他成分在不同溶剂中溶解度的差异进行分离。

常用的溶剂浸提法有Collier法 和Ullah法 两种。Collier法提取制备茶黄素的方法为：取红茶，80℃水溶液浸提5min，浸提液过滤、浓缩、冷冻干燥，干燥物用甲醇和水（体积比3:1）溶解，再用三氯甲烷萃取，除去咖啡碱等杂质，水相减压浓缩，除去甲醇和三氯甲烷，乙酸乙酯反复萃取5 次，萃取液用硫酸镁脱水，30℃下蒸馏至干，得到茶黄素粗提物。该方法工艺比较简单，但是有机溶剂用量多。Ullah法提取制备茶黄素的方法为：用适量的磷酸二氢钠与乙酸乙酯混合萃取，茶红素能全部被固定在水相中，而茶黄素被固定在有机相中，红茶用80℃水溶液浸提5min，过滤，滤液经减压浓缩，再经三氯甲烷萃取，除去咖啡碱等杂质，然后用磷酸二氢钠和乙酸乙酯混合萃取3 次，乙酸乙酯层经减压浓缩干燥，得茶黄素粗提物。该方法简单，只需一次萃取，但仍然存在使用有机溶剂较多的问题。

目前，工业化提取制备茶黄素一般不使用溶剂浸提法来制备，一方面是因为溶剂浸提法仅能得到茶黄素粗提物，且存在处理步骤繁琐、有机溶剂用量大、能耗较大、成本较高，以及有毒性等问题；更重要的一方面是因为红茶中茶黄素含量极低，仅为0.3%~2.0%，直接从红茶中提取制备茶黄素，非常不经济。

2．体外氧化制备法

虽然溶剂浸提法不能用于茶黄素的工业化制备，但却为儿茶素体外模拟氧化法制备茶黄素的形成机理及作用机制等研究奠定了基础。红茶发酵理论表明，茶叶中的儿茶素类物质在发酵过程中按照“儿茶素→醌类→茶色素（茶黄素、茶红素和茶褐素等）”反应进行，这一理论被后来的儿茶素体外模拟氧化实验所证实，并由此揭开了儿茶素体外氧化制备茶黄素的开端。

儿茶素体外氧化制备茶黄素，按催化剂的不同可分为酶促氧化制备法和化学氧化制备法两种。许多学者都对儿茶素体外模拟酶促氧化和化学氧化制备茶黄素的工艺技术进行了研究，取得了较好的效果。酶促氧化制备法和化学氧化制备法在 形成机理上存在一定差异，氧化制备途经、氧化产物组成及儿茶素残留等方面也有所不同，但都可以得到与红茶中相同的茶黄素类物质，而且选择反应原料、催化 剂、温度、时间等制备工艺技术参数，可以有目的地制备需要的茶黄素类物质，可以高效、便捷地应用于工业化制备，因此体外氧化制备法被广泛应用于茶黄素的制 备，是目前工艺比较成熟的制备方法。

（1）体外酶促氧化制备法。体外酶促氧化制备茶黄素，主要是利用茶叶本身的多酚氧化酶（PPO）的氧化特性有目的地生产茶黄素，其机理是多酚氧化酶对儿茶素进行氧化，导致醌类的形成，再经非酶性次级氧化变化，从而生成茶黄素和茶红素等色素物质。酶促氧化制备法方面的研究较早、方法新颖且成果显著，常采用的方法有茶鲜叶匀浆悬浮发酵法 、双液相酶促氧化制备法 和固定化酶制备法^[11-13]等，都取得了较好的进展。

茶 鲜叶匀浆悬浮发酵法的工艺流程为：茶鲜叶→破碎→发酵→过滤→浓缩→乙酸乙酯萃取→回收溶剂→干燥→茶黄素。茶鲜叶匀浆悬浮发酵的核心工艺为液态发酵，基 质是多酚类物质，多酚氧化酶是重要氧化酶类，多酚类物质经酶促氧化形成茶黄素和茶红素。由于酶促氧化需要足量氧气参与反应，供氧能力便成为悬浮发酵的限制 因子，供氧限制主要发生在发酵早期，虽可采取提高供氧水平或降低悬浮液浓度加以克服，但从工业生产角度出发，两种方法均意味着生产成本的提高和设备消耗的 增加，为降低成本、提高茶黄素含量，采取分批补料发酵方式则更为经济实用。夏涛等 进行茶鲜叶匀浆悬浮发酵最佳工艺的研究表明，温度28.5～29.2℃，pH值4.6～4.8，供氧13.0～15.0mL/min，发酵时间55.5～59.9min，有利于茶黄素的形成。

由于茶鲜叶匀浆悬浮发酵法制备茶黄素一般是在水相中进行，但水中的溶氧量较少，只有1.2～5.2mg/L，而供氧能力是茶鲜叶发酵的限制因子，因此常采用双液相酶促氧化制备法，通过在单液相（水相）中加人某些有助于增大溶氧水平的有机溶剂（酯相）构成双液相体系，提高供氧能力，从而提高茶黄素的形成效率。萧伟祥 等研究了双液相酶促氧化制备茶黄素。结果表明，在茶多酚酶促氧化条件下，双液相中溶氧量比单液相增大2.2倍，PPO的稳定性也增强，活性提高了209％，利用双液相酶促氧化法制备的茶黄素，其含量可达到45.0%以上。

前 面所述两种酶促氧化法，虽然都可以得到茶黄素产品，但是存在一个关键性的问题，即酶促氧化制备法中的关键因素——多酚氧化酶容易失活且不易重复利用。固定 化酶制备法可以较好的解决这个问题，它是用适当的物理方法和化学方法把酶液中的酶固定于某一载体上，使酶活性的损失降低到最小程度，既较好的保持了酶本身 的专一催化特性，又能在连续反应之后回收和重复使用。固定化酶法从1916年Nelson和Griffin发现到现在已有80多年的历史，固定化方法和技术已经比较成熟，并不断得到完善与发展。目前已研制成功的固定化酶有上百种，按制作方法可分为：载体结合法、交联法、包埋法。由于化学工业中不断有新的载体、交联剂和包埋剂的发现，因此酶的固定化技术也在不断完善。

将多酚氧化酶的固定化技术应用于茶黄素制备，也已经取得了较大的进展。李荣林 等曾做过用海藻酸钠包埋、戊二醛交联多酚氧化酶的化学性质的研究，确定了多酚氧化酶经包埋后的贮存稳定性增加，最适pH移至7.0，最适温度上升至40℃，酶对金属离于(铝离子、铜离子)的适应性也明显增强，对抑制剂的敏感性下降；屠幼英 等应用固定化多酚氧化酶法催化高纯度茶多酚生产高纯度茶黄素，其研究表明，固定化多酚氧化酶法制备茶黄素的较优条件为，时间49min、酶与底物之比为1:128.7、通气量23.81L/min、底物浓度5.95mg/mL和pH值4.3，在该反应条件下，可使高纯度的茶多酚氧化聚合生成高纯度的茶黄素，最终可得到茶黄素含量75.0%以上的茶黄素产品。由此看来，将多酚氧化酶定向固定，其酶活力和茶黄素的含量都有所提高，这一技术应用于茶黄素的制备已经成为一个新的研究热点。

另外，不同来源多酚氧化酶催化茶多酚所得茶黄素的含量和组成均有明显不同，研究表明，苹果、蔬菜等外来PPO酶源也可催化茶多酚生成茶黄素。郝慧英等 通过不同底物对苹果中的多酚氧化酶的酶学性质做了系统的研究，结果表明4-甲基儿茶酚为它的最适底物；萧伟祥等 试验证明用苹果制取丙酮粉，其PPO催化茶多酚也能得到与茶PPO酶作用相同的产物，但是效果远低于茶叶本身的多酚氧化酶。这些研究拓宽了儿茶素酶促氧化剂的范围，有利于茶黄素制备技术的进一步发展。

（2） 体外化学氧化制备法。化学氧化制备法主要是利用无机氧化剂氧化儿茶素制得茶黄素。化学氧化与酶促氧化相比，它可消除酶提取纯化的困难、酶活性不稳定、反应 程度难以控制以及受氧气的制约等因素的影响，大大简化了反应体系，简单方便，因而成为一种新的制备茶黄素方法。化学氧化制备法根据儿茶素氧化体系中pH值的不同，可分为碱性氧化制备法（pH>7）和酸性氧化制备法（pH<7）。

有关体外碱性氧化法制备茶黄素方面，Roberts等 以K₃Fe(CN)₆ 和NaHCO₃为氧化剂对茶儿茶素进行碱性氧化，其氧化产物经鉴定，发现生成了与酶促氧化相同的茶黄素类物质。后来Coxon 、Nonaka 等学者都证明碱性氧化生成了与酶促氧化相同的物质，且其得率甚至超过了酶促氧化。我国学者李立祥 、宛晓春等 证明由于化学氧化与酶促氧化在氧化机理上存在差异，以及不同的影响条件，使得酶促氧化与化学氧化在氧化产物组成和含量以及儿茶素残留等方面还是有差异的。萧伟祥等 研究表明，化学氧化(K₃Fe(CN)₆/NaHCO₃)所得的茶色素制品中茶黄素(TFs)与茶红素(TRs)含量丰富，TFs含量占色素总量26.2%～30.4%，而TRs占24.6%～26.4%。宛晓春等 的研究表明，当等体积的茶多酚溶液(浓度为1.0%~2.0%）与K₃Fe(CN)₆ /NaHCO₃ (溶液按溶质质量比1.0:1.5)，在pH为7～8，温度0～25℃条件下反应15min后，调节pH到1~4以终止反应，然后用乙酸乙酯萃取两次，后经减压浓缩，真空干燥，可得到含茶黄素40%以上的茶色素类产品。

酸性氧化制备法是指在酸性条件下利用氧化剂催化儿茶素形成茶黄素的一种方法。目前这方面的研究开展得不多。李立祥 曾进行茶多酚酸性(pH5.6)氧化试验，结果发现酸性氧化产物TFs中以茶黄素-3-没食子酸茶黄素(TF-3-G)较多，茶黄素-3’-没食子酸茶黄素(TF-3’-G)、茶黄素3，3’-双没食子酸茶黄素(TF-3,3’-G或TFDG)较少，即茶多酚酸性氧化可得到较多的酯型茶黄素。但是，根据生态保护的要求，化学法生产比酶法生产将投入更多的废水处理系统费用，并且化学法缺乏底物专一性，副产品复杂，产品纯度受到一定限制。

3 柱层析法

    无论是采用溶剂进提法从红茶中提取茶黄素，还是通过体外氧化制备法制取茶黄素，所得的茶黄素纯度仍然不高，限制了茶黄素类相关产品的应用和开发。为了获得高纯度的精制茶黄素，必须采用柱层析法对其进行精制纯化制备。目前，常用的茶黄素柱层析制备法主要有纤维素柱层析法、葡聚糖凝胶柱层析法、硅胶柱层析法、聚酰胺吸附树脂柱层析法等。

Takino Y.等 应用乙酸乙酯提取，硅胶层析初步分离，纤维素柱层析精制的方法成功地分离了三种茶黄素物质TF1a、TF1b 和TF-3,3’-G，具体的方法为：红茶经煮沸、过滤、浓硫酸处理及冷却处理后，产生橙色沉淀，经乙酸乙酯提取、浓缩、冷却、过滤、沉淀、5%碳酸氢钠洗脱、水洗等处理后，得浓缩干物，丙酮溶解，加入4～5倍氯仿沉淀，干燥后得橙红色粉末状色素，硅胶层析初步分离后，再经纤维素柱层析分离制备得到茶黄素。纤维素柱层析法由于处理步骤繁琐，且产物得率较低，因此，一般不用此法制备茶黄素。亲水和亲脂的葡聚糖凝胶Sephadex LH20兼有分子筛和吸附的双重功能，广泛应用于天然产物的分离纯化制备上。Crisp in等 、竹尾忠一等 、吴雪源等 研究葡聚糖凝胶Sephadex LH20柱层析法分离纯化茶黄素，经丙酮梯度淋洗，可分离出3个茶黄素物质。Bajai K L等 应用Sephadex LH 20柱层析分离红茶茶汤，共分离制备得到五种茶黄素物质。Collier等 将葡聚糖凝胶柱层析法和硅胶柱层析法结合起来分离茶黄素，将茶黄素粗提物过Sephadex LH20柱，经丙酮洗脱、减压浓缩、萃取、干燥，得红色固体物，再经硅胶柱层析分离，得到TF、TF-3-G和TF-3’-G的混合物及TFDG，该方法分离纯化效果好，但操作复杂，需要经过两次柱层析。丁阳平等^[31-32]首次选用聚酰胺NKA大孔吸附树脂作为分离材料，对茶黄素进行薄层及柱层析分离，得到TF、TF-3’-G两个组分，含量分别为93%、85%。

在大规模工业化制备四种主要茶黄素单体方面，中国农业科学院茶叶研究所 申请了一项发明专利“一种制备四种茶黄素单体的方法”。该专利以聚酰胺树脂作为柱层析分离的填料，采用一种由酯或酮、醇和有机酸组成的特殊的混合溶剂作为洗脱系统，从茶黄素提取物中能同时分离出高纯度的茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯四种单体。该方法可用于从茶黄素提取物中分离制备大批量高纯度的茶黄素，纯度可达98%以上，适合用于大规模工业化生产。

二、新技术在茶黄素制备方面的应用

1. 高速逆流色谱法（HSCCC法）

    高速逆流色谱法（high speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世纪80年 代发展起来的一项新技术．是不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，能实现连续有效的分配功能的实用分离技术。高速逆流色谱法可避免分离样品与固体载体 表面产生化学反应而变性和不可逆吸附等情况的发生，且每次分离样品结束后，管道中残留溶剂均可冲出，不会对后续分离产生任何影响，因此高速逆流色谱法分离 样品具有高回收率。

江和源等^[34-35]首次应用高速逆流色谱法分离纯化茶黄素，溶剂系统为乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水（3:3:1:6），优化了分离茶黄素的条件，同时与Sephadex LH-20柱色谱法梯度洗脱对比，结果表明，高速逆流色谱法分离时间相对较短，可进行较大量的分离制备。Xueli Cao等 、Kunbo Wang等 利用高速逆流色谱法分离红茶茶黄素，得到纯度较高的TF和TFDG的。杨子银等 研究不同溶剂系统和NaHCO₃前处理茶色素复合物对高速逆流色谱(HSCCC)分离茶黄素分离效果，探索应用HSCCC分离茶黄素，结果表明，通过HSCCC 法可分离得到TF-3’-G、TFDG以及TF-3’-G，TFDG 的混合物。另外，国内外学者对Sephadex LH20柱层析法和高速逆流色谱法联用技术分离茶黄素技术也做了相关研究。Du Qizhen等 、Changjun Yang等 采用高速逆流色谱（HSCCC）和Sephadex LH-20柱层析联用法，对红茶中的主要茶黄素单体进行了分离。结果表明，应用HSCCC法和Sephadex LH-20柱层析法分离茶黄素，比单个分离方法更易得到纯度较高的TF、TFMG和TFDG等茶黄素物质。

在批量分离制备茶黄素方面，北京工商大学 申请了一项发明专利“一种大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法”。该专利采用了凝胶柱层析和高速逆流色谱相结合的方法，将凝胶色谱柱层析制备量大的特点和高速逆流色谱分离效率高的特点结合起来，二者优势互补，实现了红茶提取物中茶黄素(TF)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF-3’-G)、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(TFDG) 等4种主要茶黄素单体的高纯度分离制备。该方法可用于从茶黄素粗提物中分离制备十至几十克高纯度的茶黄素单体，单体纯度可达97%以上。该方法具有产物纯度高、时间短、溶剂消耗量少等特点。但是目前凝胶柱层析和高速逆流色谱法应用于工业化生产上还存在成本高、制备量相对较小等制约因素。

2．膜富集法

近年来人们越来越注重天然植物功能成分制品的安全性，使得加工过程中使用过乙酸乙酯等有机溶剂的茶黄素产品在许多国际市场上受到限制。膜分离与富集技术由于具有高效率、低耗能、常温下进行、易于放大等优点而被广泛应用于植物资源深加工 。目前，在茶叶资源膜法深加工中应用较多的是微滤、超滤、纳滤、反渗透等。肖文军等 以云南红碎茶为原料，以1:8与1:7的茶水比在90℃下浸提2次，每次30min，合并浸提液；以膜面积为1m²、孔径为0.2μm的陶瓷膜，膜面积为4m²、截留分子量为3500或10000的卷式超滤膜以及膜面积为1m²，截留分子量为300的卷式纳滤膜依次进行微滤澄清、超滤分离与纳滤浓缩，系统研究了各膜滤过程的性能表征及其效应，结果表明，微滤对料液具有很好的澄清效果，茶黄素的得率达91.85%；3500膜和10000膜超滤后，茶黄素的纯度分别为1.72%、1.00%，茶黄素的得率分别可达到27.35%、85.79%；300膜纳滤浓缩、10000膜超滤后，茶黄素截留率达93.39%，且茶黄素的纯度提高至1.14%。

膜 富集法用于茶黄素的分离制备，具有运行温度低、生产效率高、可自动连续操作等优点，但膜富集制备茶黄素仍然存在一些问题。首先，适合分离制备茶黄素的膜材 料可筛选性较小；其次，膜设备装置的死体积会严重影响产品得率；再次，料液体系应用膜分离和浓缩时，膜污染情况比较普遍，需经常清洗再生，非常费时、费 功，能耗大、成本高。总之，膜分离与富集技术应用于茶黄素的工业化制备还需要进一步探索。

三、小结与展望

茶黄素巨大的药用价值和经济价值使得对其提取制备技术进行了比较深入的研究。初制茶黄素的价值较低，要提升其价值需要提高茶黄素的纯度。聚酰胺树脂柱层析法，分离效果好、填料价格低廉、制备量大、产品纯度高，非常适合大规模工业化生产，是一种较理想的4种主要茶黄素单体制备方法，但树脂中含有残留单体、交联剂、致孔剂以及分散剂等不安全因素，因此探索高效、安全、廉价的精制茶黄素提取制备技术是研究的重点。

随 着茶黄素在医药保健、食品、化工等领域研究速度的加快，对茶黄素的大规模工业化生产的需求越来越大，因此迫切需要对茶黄素的形成机理、制备工艺等进行更深 入的研究和改进，从而建立成熟的茶黄素提取制备技术，获得高得率、高纯度、高活性的茶黄素，为茶黄素相关功能产品的开发提供强有力的技术支撑。